转录组（Transcriptome）是指特定细胞或组织中一皆转录产品，包括信使RNA，核糖体RNA、转运RNA以及非编码RNA。转录组学（Transcriptomics）是使用高通量测序技能，全面快速获取某一物种特定组织或器官在某一情状下RNA序列信息，并对其结构和抒发信息进行分析。

转录组测序（RNA-seq）即是运用高通量测序技能将细胞或组织中一皆或部分mRNA、small RNA和no-codingRNA进行测序分析的技能。RNA-seq既不错提供定量分析，检测基因抒发水平各异，又不错提供结构分析，能发现极度转录本，精准地识别可变剪切位点、基因交融等，并且不依赖于参考基因组。

现在，转录组测序已经是开展分子生物学议论、基因功能议论、分子机制议论中不成或缺的一种技能技能。在进行转录组测序之后，往往需要对分析成果中感兴趣兴趣的本色进行生物学考据。转录组测序关系的议论可从基因/转录本抒发、结构分析和RNA修饰等多个维度启程，因而不错基于此，从抒发、序列或功能等方面形成好意思满的考据实践想路。围绕这个想路，以下提供了最为全面的转录组测序卑劣实践考据表率。

伸开剩余90%一、抒发定量考据

1. 荧光定量PCR（qRT-PCR）考据基因大致转录本抒发情况

通过荧光定量PCR考据基因抒发水平，基于内参基因（管家基因：守护细胞基因代谢行为所必需的基因，在各组织和细胞中抒发相对剖判）的抒发水平，获取宗旨基因的相对定量水平，常见的内参基因包含GAPDH、β-Actin、18S rRNA等。

注：因qRT-PCR与转录组测序定量旨趣不同，一般提倡暖和基因抒发趋势是否一致。

（Zhou B, et al. Eur. J. Immunol.2023）

2. Western Blot考据卵白抒发情况

通过Western Blot（免疫思路法）考据各异基因是否在翻译水平发生变化，应用特异性抗体，符号卵白水平变化。其旨趣是运用卵白质所带分子量不同，在凝胶电泳中产生不同的电泳速率而被分离。分离后的卵白质被升沉到PVDF 膜或 NC 膜上，以固相中的卵白质或多肽行为抗原，与对应的抗体起免疫反映，再与酶或同位素符号的第二抗体起反映，经过底物显色或辐照自显影以检测电泳分离的特异性宗旨基因抒发的卵白要素。常见的抗体类型包括兔抗、羊抗、鼠抗等。

注：议论标明，卵白质与转录水平的关系性较弱，因此提倡在议论功能层面时，进行卵白质层面的考据。

（Pierattini B, et al. Mol Ther-Nucl Acids.2023）

3. Northern blot考据RNA含量

通过Northern blot考据RNA的抒发情况，且对宗旨片断大小检测有较高的明智度：Northern Blot 摄取琼脂糖凝胶电泳，凭据分子量大小不同将不同的RNA分离开来，然后将其原位升沉至固相因循物（如尼龙膜、纤维膜等）上，再用符号过的DNA或RNA探针，依据碱基互补配对的原则进行杂交，随后进行显影或显色，以检测宗旨RNA方位位置，其显影强度则可指挥宗旨RNA在所测样品中的相对含量。

（Kurihara Y, et al. Commun Biol. 2023）

二、序列定性考据

1. RT-PCR考据可变剪切

通过RT-PCR考据可变剪切，其旨趣是在剪切事件发生区域联想特异性引物以扩增特定片断，通过电泳分离产品并不雅察条带大小各异，从而考据是否存在不同的剪切形势。智力为凭据IGV浏览器笃定发生的事件及对应区域的序列，在序列区域隔壁联想特定引物，进行PCR扩增，笃定片断长度。

（Zhang H, et al. Physiol Plantarum.2023）

2. RACE考据Poly(A)

3' RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是议论mRNA 3’终局的常用技能，因为mRNA可能具有多个3’终局 PAC区域，因此可凭据该特点联想实践进行Poly(A)考据。区别于平凡的RT-PCR，3' RACE考据需要扩增出mRNA 3’终局的通盘条带，所使用的引物相对比拟特殊，正向引物录取在近端Poly(A)的左侧区域，而反向引物则录取在 Poly(A)位点上，对应cDNA上Poly(T)引物区域，反映圭臬和所用的反映体系不错按照RT-PCR来。

（Mukherjee S, et al. Front Immunol.2023）

3. RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）考据RNA定位

RNA-FISH（RNA荧光原位杂交）运用荧光符号的核酸探针与细胞内靶RNA分子进行特异性杂交，从而竣事对RNA分子在细胞内原位定位的议论。其旨趣基于碱基配对原则，通过联想与宗旨RNA序列互补的探针，在细胞经过固定、透化惩办后，让探针参加细胞并与RNA皆集，通过荧皎洁微镜不雅察到的荧光信号可精准披露RNA在细胞内的散布情况。

（Mamontova V, et al. bioRxiv. 2024）

三、RNA修饰考据

1. 雀斑杂交（Dot blot）

雀斑杂交（Dot blot）可检测和武断 DNA、RNA 和卵白质，通过显影雀斑的有无及步地的浅深来判断是否有杂交过火杂交强度。在议论 RNA 修饰时，雀斑杂交常用于对细胞内总RNA的修饰水平进行定性或半定量分析。具体智力是：将待测的 RNA 变性后点加在硝酸纤维素膜或 NC 膜上，紫社交联固定后，用m6A大致m5C抗体进行杂交，洗膜，辐照自显影，以雀斑有无或步地的浅深代表RNA修饰水平的高下。

（Sun B, et al. Plos Genet. 2022）

2. 质谱检测法（HPLC/LC-MS）

HPLC摄取串联质谱的方式，通过皆集酶惩办和离子打碎，将核酸打断成核苷和碱基，凭据出峰保留时辰和峰面积，筹谋m6A和总腺嘌呤的比例，得到mRNA的全体m6A甲基化进度。然则，此种表率无法明确发生修饰的具体RNA以及修饰的具体位置。

（Liu C, et al. Nat Biotechnol. 2022）

3. MeRIP-qPCR

用以对宗旨基因上的某个修饰位点（以一小段区域的形势，MeRIP法精准不到单碱基）的修饰水平进行考据。其旨趣同MeRIP-seq测序中MeRIP实践换取，实践基本操作也一致：对RNA进行片断化，然后将片断化后的RNA样品分为二部分：一部分用于免疫共千里淀实践（IP）后行为IP样品，另一部分不进行IP平直行为Input样品。之后再凭据实践宗旨的不同，对两部分RNA片断进行逆转录和qPCR。

（Price A M, et al. Nat Commun. 2020）

4. MeRIP-seq

meRIP-seq是参考Chip-seq发展出来的一种武断RNA修饰的表率，现在meRIP-seq已见效应用于m6A和m5C的检测。其旨趣和智力为：领先通过polyA拿获mRNA，大致通过rRNA剔除技能去掉rRNA，然后将获取的RNA打成100nt独揽的小片断；之后使用修饰特异性的抗体（m6A或m5C抗体）进行免疫共千里淀，含有修饰的RNA片断被富集并回收；进而对回收的RNA进行文库构建、高通量测序和生物信息学分析，通过peak分析武断出RNA修饰的区域。

四、基因功能考据

1. 基因敲除

基因敲除是通过不同计谋竣当事者见基因功能丧失以深远琢磨其生物学作用的枢纽技能。主要包括插入突变、RNA滋扰和CRISPR/Cas9基因裁剪三种表率。其中RNA滋扰是通过联想与内源mRNA同源的dsRNA，经Dicer酶加工成siRNA，形成RISC复合物切割靶mRNA，抑遏基因抒发；CRISPR/Cas9系统运用sgRNA带领Cas9卵白在基因组精准位置切割DNA，通过NHEJ开垦机制形成基因功能丧失。

2. 基因过抒发

基因过抒发是通过将宗旨基因编码区序列CDS构建到质粒或病毒等载体上，运用载体上的调控元件竣事基因在东谈主为截至条目下的大都转录和翻译。这依然过有两种主要计谋：瞬时转染和剖判转染。瞬时转染是将外源基因载入细胞但并不整合到染色体中，能在短期内获取高水平的基因抒发产品，适用于快速制备极少至中量的重组卵白；剖判转染则是将宗旨基因整合到宿主细胞染色体中，形成剖判抒发且不错遗传给后代的细胞株。

五、分子互作考据

1. 双荧光素酶检傍观证RNA与RNA互作

双荧光素酶检测可用于考据RNA与RNA互作。其基应允趣是将待测RNA片断别离与两种酶发扬基因构建交融抒发载体，各自产生不同类型的荧光信号。实践中，当两种含有所议论RNA片断的交融卵白在细胞内抒发时，若这两种RNA之间存在互作，则会更正各自的构象或剖判性，进而影响各自所联贯的荧光素酶活性。通过检测荧光信号强度的变化，即可判断RNA间是否存在相互作用。

2. RNA pull-down考据RNA与卵白互作

RNA pull-down是通过特定的RNA分子（时时是已知的非编码RNA或mRNA的片断）来富集与之相互作用的卵白质，以便进一步议论RNA与卵白的互作。该实践是在已知宗旨RNA存鄙人，琢磨与其皆集的卵白。RNA pull-down是使用体外转录法符号生物素RNA探针，然后与胞浆卵白索求液共同孵育，形成RNA-卵白质复合物。该复合物可与链霉亲和素符号的磁珠皆集，从而与孵育液中的其他要素分离。再运用游离生物素竞争洗脱复合物，通过Western Blot实践检测特定的RNA皆集卵白是否与RNA相互作用，大致皆集质谱（Mass Spectrometry）筛选RNA皆集的未知卵白。

3. 酵母双杂交考据卵白与卵白互作

酵母双杂交技能是一种运用活体酵母细胞来检测和考据两个宗旨卵白质之间是否存在相互作用的表率。其基应允趣是将待测卵白A与酵母转录因子的激活扣构域交融抒发，同期将卵白B与转录因子的DNA皆聚会构域交融抒发。当卵白A和卵白B在酵母细胞内发生相互作用时，会再行拼装成一个好意思满的功能性转录因子，进而激活特定发扬基因的抒发。实践智力主要包括构建交融卵白抒发载体、转入酵母细胞、筛选阳性克隆以及发扬基因活性检测。通过不雅察酵母细胞的滋长情况及发扬基因抒发水平，即可判断两种卵白质间是否存在相互作用。（起头：贝纳科技）

发布于：江苏省